公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

該制品為單一組分的 MasterMix（2 倍濃度），包含了反應緩沖液、Mg2+、dNTP、Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶等，使用時只需要加入引物、模板即可進行核酸恒溫擴增。Bst4.0 DNA/RNA 聚合酶具有依賴于 RNA 模板的聚合酶活性（逆轉錄），還具有依賴于 DNA 的聚合酶活性，因此無論DNA 或 RNA 樣本均可使用該制品進行高效的恒溫擴增。該制品是進行 LAMP 及 RT-LAMP 擴增反應的試劑。優化的反應體系，確?？焖俚耐瓿蓹z測試劑的反應體系建立。該系列產品不包含任何其它輔助染料，在 LAMP 的擴增搭配 OG 橙綠變色管進行可視化變色反應。除此外，該制品還可以用于其它恒溫擴增實驗，包括 CPA、SMAP 等。
儲存：長期保存制品于-20℃，保存 2 年。
使用實例（以 LAMP OG 橙綠變色為例）橙綠變色染料（OG Dye）以凍干的形式預加在 8 聯管蓋上。在 LAMP 反應完畢后（在反應完畢前，務
必不能將管蓋上染料混入反應液中），將 0.2ml EP 管顛倒溶解 OG 染料后。LAMP 的反應產物將與 OG 染料形成強烈的綠色肉眼可見變色反應（陽性），而未發生擴增的 EP管為深橙色（陰性）。
（1）配制反應體系
在 0.2ml EP 反應管中加入下述試劑
2xBst 4.0 Basic Mix 10 μl
*10xLAMP Primer Mix 2 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 20 μl
*10xLAMP Primer Mix 濃度：FIP/BIP 分別為 16 μM、LoopF/B 分別為 4 μM、F3/B3 分別為 2 μM全部試劑加入完畢后，輕彈 EP 管底部后，再蓋上 OG 橙綠變色管（蓋上管蓋后務必不能再劇烈混合與倒置，以防止將管蓋上的 OG 染料溶解，OG 染料一旦混入反應液中將會終止 LAMP 反應）。
實驗 LAMP Primer Mix 分別采用 1、1.5、2 μl，以陰性不變色，陽性樣品正常變色為標準，作為后續測試用量。
（2）反應體系配好后，置于 60~68°C（實驗采用65°C）進行反應 20~45min。（擴增良好的引物組合，通常 25min 即可變色，一般不超過 45min，實驗設置20、25、30、45min）。
（3）觀察結果：觀察結果時，盡可能不要與配制反應空間共用，以防止污染操作臺。將反應 EP 管倒置，并手腕輕甩，反應液浸泡 EP 管蓋上的 OG 染料，靜置 30s。再將 EP 反應管正置，并輕甩反應液到 EP 管底部，此時擴增樣品將變為鮮艷肉眼可見綠色，而陰性未發生擴增的管將為深橙色。
注意事項
1. 在用于其它恒溫擴增反應時（如 CPA、SMAP 等），可參考如上策略進行使用，反應時間可能會需要調整。
2. 關于礦物油的使用，在配制完 LAMP 反應體系后，可加入一滴礦物油覆蓋于反應液上部，以減少氣溶膠的污染。
3. 鑒于特殊的生產工藝， 全系恒溫擴增 Mix 系
列均不能進行濁度分析。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環節的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環組成，每個循環包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環數:

其他參數選定后，PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環次數。循環次數越多，非特異擴增增加。

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