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Ribonuclease R(Rnase R) 核酸外切酶

簡要描述:

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更新時間:2024-01-14

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Ribonuclease R(Rnase R) 核酸外切酶

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Ribonuclease R(Rnase R) 核酸外切酶

500U

A-PJ1136

Ribonuclease R(Rnase R) 核酸外切酶

5000U

A-PJ1136

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RNase R 來源于 E.coli,通過基因工程重組表達,該酶為 Mg2+依賴的 3’-5’核糖核酸外切酶。其可消化所有線性 RNAs 底物,但不能消化環狀 RNA(circular RNA)、套索 RNA(lariat RNA)、雙鏈 RNA、3’突出端<7nt 的雙鏈RNA。本酶可高效的去除不含二級結構的線性 RNA,從而純化獲得環 RNA 分子,用于后續 RNA-sequencing 等實驗。

活性定義:在 20 mM Tris-HCl(pH7.5),100 mM KCl,0.5mM Mg2+條件下, 37°C 下水解 1 μg 的 poly-r(A)產物,所需酶量為 1 個活性單位。10xRNase R Buffer:200 mM Tris-HCl, 1 M KCl,5 mM
MgCl2,pH7.5
酶儲存液:20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM DTT ,50% Glycerol, 0.1% (w/v) Tween-20, pH 7.5。
儲存:置于-20°C 可保存 3 年,避免反復凍融。
使用方法
1. 配制反應體系
RNA 1-10 μg
10xRNase R Buffer 2.5 μl
Rnase Inhibitor (40 U/μl) 0.5 μl
RNase R (20 U/μl) 1-2 μl
DEPC-treated Water up to 25 μl
2. 37℃孵育 30-60min,反應完畢后可加入 5 mM EDTA終止反應。
使用注意事項:
(1) 在 total RNA 的消化中,由于含有二級結構較多的RNA,如 tRNA、rRNA、dsRNA 等,RNase R 對該類底物消化活性大幅下降,此時需要延長消化時間至 2h,并在 1h 時補加 RNase R 進行消化。必要時將反應溫度提高至 45℃,以打開含有二級結構的 RNA 分子。
(2) 對于含有 highly structured 的 RNAs,RNase R 仍然無法消化, 稍后將推出 5’-3’的核糖核酸外切酶以解決此類問題。
(3) 據其它文獻報道,在含有 highly structured 的 RNAs,可放大反應體積至 50 μl,可降低二級結構的影響,從而促進 RNA 的降解。
(4) 高溫和長時間的孵育,可能導致 RNA 的非酶性斷裂(水分子的 H+對二酯鍵的攻擊)。因此,消化時間、反應溫度均需要根據特定的實驗進行優化和調整。


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PCR基本步驟及注意事項?

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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